本期分享清华大学李梢教授课题组最近在Phytomedicine(影响因子4.)发表的文章《网络药理学探讨血必净治疗脓*症的抗炎机制》。
摘要
背景:血必净(XBJ)是一种治疗脓*症的中成药。然而，其作用机制尚不清楚。
目的:从网络药理学的角度探讨XBJ治疗脓*症的作用机制。
研究设计:基于网络药理学，将计算预测、实验验证和文献报道的临床结果分析相结合。
方法:采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)识别XBJ的代表性化合物，并采用网络算法预测各化合物的靶标。通过对靶标谱的层次聚类，将XBJ包含的化合物与FDA批准的脓*症药物或实验药物进行比较。通过富集分析确定XBJ治疗脓*症的关键生物功能模块。通过脓*症相关的公共组学数据集，对每个生物功能模块进行差异表达分析。构建了中药-生物功能模块网络，揭示了中药组合模块的部分传统规则。实验上，通过定量转录谱检测和脓*症动物模型，验证XBJ的化合物对生物功能模块基因的作用。临床方面，结合文献记载的临床结果、计算和实验结果，解释XBJ治疗脓*症的抗炎作用。
结果:化合物的靶谱覆盖了文献报道的该化合物的大部分相关生物分子，可以表征该化合物的综合功能。XBJ与FDA批准的药物或实验药物具有相似的药理作用。确定了XBJ治疗脓*症的4个关键生物学功能模块:炎症、免疫、细胞凋亡和凝血。细胞系实验结果表明，XBJ部分成分对炎症模块基因表达有调控作用。动物实验表明，XBJ化合物可降低IL-1beta的表达水平。结合文献报道的临床结果，发现XBJ通过调节NF-kappaB信号通路发挥抗炎作用。
结论:将计算预测、实验验证和文献报道的临床结果分析相结合的网络药理学框架,为分析XBJ治疗脓*症的MoA提供了一种新的方法。
一、研究路线
研究路线见下图。
二、血必净的化合物
用LC-MS/MS检查到XBJ包含的24个化合物见下图。各个峰对应的化合物分别是：1.Succinicacid;2.Gallicacid;3.Danshensu;4.protocatechualdehyde;5.Oxypaeoniflorin;6.Chlorogenicacid;7.SafflominA;8.Paeoniflorin;9.Ferulicacid;10.Taxifolin;11.Vitexin;12.Rutin;13.Ferulaldehyde;14.kaempferol-3-O-rutinoside;15.Eriodictyol;16.Ethylcaffeate;17.Quercetin;18.Luteolin;19.Naringenin;20.Benzoylpaeoniflorin;21.Apigenin;22.Kaempferol;23.Chrysoeriol;24.Formononetin
图2XBJ化合物的质谱分析结果
三、XBJ中化合物的靶标预测及文献验证
使用课题组开发的基于网络的预测算法DrugCIPHER得到每个化合物的靶标谱，并选取前个预测靶标作为每个化合物的网络靶标。
然后用文献挖掘验证预测的靶标。从PubMed和CNKI数据库中搜索每个化合物的名称，根据摘要中的化合物名称及与该化合物相关的生物分子，提取摘要中的生物分子作为化合物的靶标。文献验证结果表明，每个化合物的预测靶标可以覆盖文献报道的靶标的80%-90%(图3A)，说明每个化合物的功能表征是全面的。图3A中，赤芍中代表性化合物芍药苷87%的预测靶标与已报道的生物分子相关。另外13%的预测靶标，位于与报道的生物分子相关的信号通路上游，如图3B所示。
图3预测靶标的文献验证结果.(A)每种化合物所报告的生物分子对预测靶标的覆盖率。(B)在图3A中，一些与报道的生物分子直接或间接无关的芍药苷的预测靶点，位于与文献报道的生物分子相关的信号通路的上游。
三、基于无监督的层次聚类，发现XBJ具有与FDA批准的脓*症药物或实验药物相似的药理作用
选择19种代表不同MoA的脓*症治疗的FDA批准的或实验药物(表S2)，用于与XBJ的24个化合物进行比较。
对于XBJ的24种化合物及19种脓*症治疗药物，从DrugCIPHER中获得每个化合物针对所有种可用药靶标的得分，得到该化合物的靶标谱，进行层次聚类。取最优的WSS(图4A)，得到4个聚类簇（图4B的4个不同颜色），发现具有相似特征的XBJ化合物在很大程度上聚在一起(图4B)。
图4。比较XBJ化合物和治疗脓*症的FDA批准药物或实验药物。(A)评价和确定分组数目。用WSS确定了最优分割是4个簇。(B)XBJ和治疗脓*症的FDA批准药物或实验制剂中化合物的分层聚类结果。
图4B显示，XBJ的22种化合物与针对脓*症的抗炎药、针对凝血系统、免疫系统或炎症介质的药物聚在一起，提示XBJ可能与抗脓*症的FDA批准的药物或实验药物具有相似的药理作用，具有发挥抗炎、免疫调节和改善凝血的物质基础。
四、XBJ通过调节炎症、免疫、细胞的生物功能模块治疗脓*症
为了评估靶标蛋白与中药复方的药理作用相关的概率，将XBJ中所有化合物的靶标谱中每个靶标蛋白的出现次数与用泊松二项式统计模型表示的纯随机过程进行了比较，由此确定了XBJ的靶标。然后，建立了由与脓*症相关的关键生物功能模块组成的生物功能模块网络。最后，用DAVID计算XBJ的靶标在生物功能模块网络中的富集。结果表明，XBJ靶标显著富集的GO生物过程或KEGG信号通路主要分布在炎症，免疫，细胞凋亡和凝血等模块中，如表1所示。
以与确定XBJ靶标相同的方法，推断了复方中每种草药的靶标，并通过表1中的GO生物过程/KEGG信号通路对每种草药的靶点进行了富集分析，结果如图5A所示。构建了一个关键的草药-化合物-生物功能-分子网络，以揭示草药、化合物、生物功能和分子之间的关系（图5B）。这些结果可以帮助我们从分子网络的角度更好地阐明XBJ治疗脓*症的组合规则。例如XBJ的君药红花具有活血、化瘀、止痛的作用，它调节炎症、免疫、细胞凋亡和凝血功能障碍功能模块。XBJ的臣药赤芍具有清热、凉血、活血化瘀的作用，它调节炎症和细胞凋亡的功能。此外，当归为佐药，具有益气强身的作用，它调节炎症、免疫和凝血功能障碍模块。
图5草药靶点和复方生物功能模块-分子网络的富集分析。(A)各草靶标的富集分析。(B)XBJ的草药-化合物-生物功能模块-分子网络。草药与生物功能模块之间的灰线表示预测的关系，而粗黑线代表了与TCM中草药的传统功能相关的预测关系。
图5B中化合物和靶基因的选择规则如下:
化合物的选择规则：
(1)《中国药典(年版)》中记载的该草药的测定标志化合物;
(2)文献中经常报道的化合物或发挥主要药理作用的化合物;
(3)能够显著富集至少一个与XBJ相关的关键GO生物过程/KEGG信号通路的化合物。
靶基因的选择规则:
(1)基因的表达可以表征生物功能模块的变化。如抗凋亡调节因子BCL-2和细胞凋亡执行相关分子CASP3可反映细胞凋亡水平;
(2)与脓*症发病机制及XBJ作用相关的基因。例如，XBJ通过促进脾脏BCL-2的表达，降低CASP3的激活，减轻淋巴细胞的凋亡，从而改善脓*症大鼠的免疫(见TableS4)。
图5B的连边规则如下：
(1)如果一种化合物在某种草药中被鉴定出来，则该化合物与这种草药相连。
(2)在某生物功能模块相关的生物学过程或信号通路中，如果该草药是富集水平最高的3个(P0.05)，则该草药与该生物功能模块相关的生物过程或信号通路相连。
(3)如果一个生物功能模块与另一个生物功能模块在7个相关的KEGG信号通路或GO生物过程中有相同的基因，那么它们之间就有连边。
(4)如果一个基因与另一个基因在蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络中有边，那么它们就连接在一起。
需要注意的是，这里只展示了部分基因之间的边和生物功能模块之间的边。
五、XBJ具有发挥抗炎作用的物质基础——基因表达及动物实验验证
根据图5B中的草药-生物功能模块网络，构建各生物功能模块的化合物-基因子网络。如图6A和6B所示，脓*症患者NF-κappaB信号通路关键基因明显增多，提示脓*症患者可能发生炎症因子过表达。阿魏酸、山柰素、芍药苷和槲皮素降低NF-κappaB1和NF-κappaB2的表达。这些结果表明，XBJ确实具有调控这些生物功能模块的物质基础。
图6。败血症的发病机制和XBJ的作用。(A)败血症的发病机制和XBJ对炎症生物功能模块的治疗作用。(B).在TCM成分基因表达图谱库中，炎症生物功能库、组学数据证据(表S6)和XBJ成分对炎症生物功能模块的影响。粗线指在基因表达谱资料库中已被证实的差异干预的关系。(C).XBJ、羟基*A、芍药苷、阿魏酸酸对动物脓*症模型IL-1β表达水平的调节作用。
动物实验：每组8只动物。6h时，正常组与假手术组无明显差异。与假手术组比较，CLP组肝脏中IL-1β升高，但不显著。而与正常组相比，CLP组IL-1β显著升高。实验组和阳性对照组XBJ均能显著降低IL-1β的表达，且芍药苷组IL-1β的均值低于XBJ组。24h正常组与假手术组无明显差异。与正常组和假手术组比较，CLP组IL-1β明显升高。试验组阿魏酸和阳性对照组羟花*A均显著降低IL-1β水平。动物实验结果也验证了网络药理学方法的预测结果。在DrugCIPHER的预测结果中，IL-1β出现在羟花*A和阿魏酸的前个靶标中，分别为95和46个(总靶标:)。动物实验结果与细胞系实验结果一致。如图6B所示，芍药苷和阿魏酸均可抑制IL-1β上游NF-κappaB1的表达。
XBJ的靶标富集炎症生物学功能模块(图5B)，提示XBJ对脓*症有抗炎作用。XBJ靶蛋白显著富集NF-kappaB信号通路(P=1.14E-03)(表1)。实验结果显示，阿魏酸、山柰素、芍药苷和槲皮素显著降低了NF-kappaB信号通路关键基因NFκB1的表达(图6B)。NFκb1介导NF-kappaB信号通路下游分子的释放，如TNF-α、IL-1β、NFkB2、IL8、IL6、VCAM1和COX2，从而调节促炎/抗炎平衡(图6A)。XBJ可降低脓*症术后患者IL-1β等炎症因子(Shuying,)。在临床中，严重脓*症患者的细胞因子水平，如TNF-α和IL6较高(Kellumetal.，)。XBJ可显著降低严重脓*症患者治疗7天后血清TNF-α和il-6浓度(Zhaoetal.，)。XBJ还可以调节脓*症患者的pro/抗炎平衡(Liuetal.，)。以上结果表明，XBJ对脓*症具有临床抗炎作用，其机制是通过调节NF-kappaB信号通路中的分子。
参考文献：
WuaiZhou,XinxingLai,XinWang,XiaoqingYao,WeihuaWang,ShaoLi,Networkpharmacologytoexploretheanti-inflammatorymechanismofXuebijinginthetreatmentofsepsis
Phytomedicine,,,ISSN-,