论文标题：Animmune-cellsignatureofbacterialsepsis
刊登日期：年03月
发表杂志：NatureMedicine
影响因子：45.9
研究机构：美国麻省理工学院Broad研究所和哈佛大学等
概况与摘要细菌感染所导致的免疫失调容易引起脓*症，并进一步导致人体残疾。但在脓*症发生过程中，免疫细胞的转录状态却仍未知晓。因此，为了进一步研究脓*症发病的机制并探究其具体机理。作者开展了单细胞实验，分析了29个脓*症患者和36个对照组的血液样本，共计,个PBMCs和19,个树突状细胞（DC）。通过分析，作者首先根据它们的基因表达谱聚类，定义出16种免疫细胞状态。接着通过单细胞实验，作者在脓*症患者体内发现了一种独特的CD14+单核细胞状态，并通过已发表的转录组数据分析发现，该细胞具有将患者与正常人区分的能力。最后，确定了可以用于分离和定量MS1状态单核细胞的表面标记，并对其表观基因组和功能表型进行描述，提出了一个由人类骨髓诱导产生MS1状态细胞的模型。
结果展示本实验共招募了不同年龄以及属于不同脓*症进程的患者（图a和b），并对这些患者体内的CD45+PBMCs（-个/患者）和LIN-CD14-HLA-DR+树突状细胞（-个/患者）进行单细胞测序。
Leuk-UTI：白血球增多的尿道感染
Int-URO：伴有轻度或短暂器官功能障碍的尿道感染
URO：伴有明显或持续性器官功能障碍的尿道感染
Bac-SEP：感染败血症的细菌血症患者
ICU-SEP：重症败血症患者
ICU-NoSEP：重症非败血症患者
一、scRNA-seq定义了脓*症患者的免疫细胞状态作者先是对获得细胞进行了初步的鉴定，种类有：T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞和巨核细胞6种细胞类型（图a和b）。并且根据以上的细胞定义，将每种细胞进行再分群，得到不同的细胞亚型。作者进一步发现，MS1型的单核细胞高表达包括RETN、ALOX5AP在内的与脓*症高度相关的基因（图c）。
二、MS1状态的单核细胞比例在脓*症患者的血液中呈现上升趋势根据以上信息作者推测MS1细胞可能与脓*症的发生高度相关，因此作者进一步对MS1进行深入探究。
首先作者发现血液中单核细胞的丰度比例与个人的疾病状态密切相关，其中MS1细胞在脓*症患者（Int-URO、Uro、Bac-SEP和ICU-SEP）的比例略高于未感染的重症患者（ICU-NoSEP）（图a）。
接着对ICU-SEP和ICU-NoSEP的差异分析发现胎盘特异蛋白8（PLAC8）和聚集素（CLU）在ICU-SEP高表达，其中PLAC8的表达还与脓*症有关（图c）。
最后采用非负矩阵分解（NMF）算法对MS1细胞中的共变基因进行分析，共发现五个脓*症相关的基因模块。其中MS1-A对应的线粒体模块与脓*症患者的疾病严重程度显著相关，支持了脓*症中能量代谢变化和免疫麻痹之间的联系；而MS1-B是抗炎和促溶解反应相关的基因模块，这个模块与脓*症患者的疾病严重程度负相关（图b）。这恰好符合目前的脓*症模型，即患者在病程早期炎症状态增强，但随后转为免疫抑制状态。
小知识：本文采用NMF算法的目的是若一组基因具有相似的功能或者出现在同一个生物通路中，则可以将它们视作一个模块；而相比于复杂冗余的单个基因，在协同表达的基因模块（genemodule）水平上研究模块与外界变化的关系，将大大降低问题的复杂程度。
三、验证MS1状态的单核细胞能否作为脓*症的标志物正如上一张图中所观察到的，MS1状态的单核细胞在脓*症患者血液中的比例与病情进程之间的正相关关系，作者猜测它是否可以作为脓*症发病的标志物。
作者利用ROC（患者工作特征曲线）和Meta分析进行验证。
通过与另两种已报道的ROC曲线指标相比，MS1占比的AUC更大（MS1fraction=0.92,FAIM3/PLAC8ratio=0.81,SeptiCyteLab=0.74），更适于作为脓*症的特异标志物（图a）；进一步分析已发表的脓*症相关scRNA-seq数据集，同样发现MS1占比作为脓*症的分类标准更具有普适性（AUC=0.90）（图d）。
Meta分析也发现MS1占比分类标准可以很好的区分脓*症患者与健康人群（Effectsize=1.9）（图b），但无法十分有效的区分脓*症患者与非感染性炎症患者（Effectsize=0.32）（图c）。因此，利用MS1相关的高表达基因（PLAC8、CLU）去区分，可以有效地区分脓*症患者（ICU-SEP）和未感染脓*症患者（ICU-NoSEP）（图a和e）。
小知识：
1、患者工作特征曲线（Receiveroperatingcharacteristiccurve,ROCcurve）是以假阳性率（Falsepositiverate,FPR）为横坐标，真阳性率（Truepositiverate,TPR）为纵坐标绘制的各点连线；其反映了不同的判定标准下所得的X对Y的反应性或称预测准确率情况，在医学中常用于判断某种因素对于某种疾病的诊断是否有诊断价值。横坐标FPR=（预测为正，实际为正）/（预测为正+预测为负），亦表示1-特异性，纵坐标TPR=（预测为正，实际为负）/（预测为正+预测为负），亦表示敏感度，ROC曲线被看作是反映敏感性与特异性之间关系的曲线，曲线AUC越大，越趋近左上角，则表示诊断指标的灵敏度和特异性越好。
2、荟萃分析（Meta分析）是对具备特定条件的、同课题的诸多研究结果进行综合的一类统计方法。为判断MS1是否能作为脓*症marker，研究者对已发表的脓*症患者scRNA-seq数据进行分析，评价MS1占比在区分脓*症患者与正常人（A）、非感染性炎症患者（B）中的能力。Meta分析结果以森林图（forestplot）展示，即在平面直角坐标系中，以X=0或X=1（本文为1）为无效线，用若干条平行于X轴的的线段表示每个效应量的大小（蓝色矩形中点）及其95%置信区间（线段全长），每条线段代表一次研究，蓝色矩形面积与每个研究所占权重成正比。最下面的Summary代表Meta分析各研究的汇总结果，以菱形表示。
四、MS1状态细胞的表面标记虽然MS1细胞可以作为脓*症标志物，但每个患者都利用单细胞测序检测是否存在MS1细胞明显不可行。因此为了提高MS1细胞在临床中的广泛应用性，作者利用单核细胞的marker进行流式分选发现，HLA-DRlo、IL1R2hi表达可用于定量MS1细胞的比例（图a）。
那么此种分类标准是否真的能分离出MS1细胞呢？
作者发现相对于对照组和Leuk-UTI患者，int-URO和URO患者中HLA-DRlo、IL1R2hiCD14+单核细胞的比例明显更高（图b）。而且，流式测定此种细胞占比与scRNA-seq测定的占比显著相关（图c）。最重要的是，当我们将此类细胞（来自5个URO患者的个细胞）与原始数据一起分析并投射到相同的t-SNE图时，发现此类细胞与原始数据中的MS1细胞共定位（图d）。
五、MS1样细胞来源于人的骨髓既然MS1细胞作为脓*症标志物具有广泛应用性，那么它又是如何分化来的呢？
研究发现HLA-DR地表达与单核细胞不成熟有关，而单核细胞不成熟会导致对刺激的反应性降低。因此，作者猜测MS1可能来源于骨髓单核细胞（BMMC）。
为了验证这个猜想，作者模拟细菌感染的条件，使用Pam3CSK4（Pam3）或脂多糖（LPS）对BMMCs进行慢性刺激，发现HLA-DRloIL1R2hiCD14+细胞群出现了（图a）。并且，随着LPS或Pam3处理时间增加，这种细胞群的丰度在BMMCs中显著增加，而在PBMCs中没有增加（图b）。此外，经LPS或Pam3处理的BMMCs的scRNA-seq分析显示，有一个细胞群高表达MS1的标记基因，但在未处理的BMMCs中就没有（图c）。
接着通过拟时序分析发现在LPS和Pam3CSK4刺激下，细胞沿HSC/MPP→CMP→GMP→Mono→iMS1的轨迹分化，若无刺激，则无法分化产生iMS1细胞（图d）。
因此，人类骨髓细胞具有产生脓*症MS1状态细胞的潜力，这也进一步支持了由于造血前体分化失调导致血液中重编程骨髓细胞出现的假说。
注：HSC/MPP，造血干细胞和多能祖细胞；CMP，普通髓系祖细胞；GMP，粒系-巨噬系祖细胞。
六、MS1细胞的表观遗传和转录因子为了进一步研究MS1在脓*症发病过程中起到的作用及具体的响应机制，作者研究了MS1的表观遗传和转录因子信息。
健康人外周血单核细胞（PB-Mono）、脓*症患者外周血单核细胞（PB-MS1）、健康骨髓单核细胞（BM-Mono）、LPS和HSC细胞因子刺激的BMMCs细胞（BM-iMS1）四个群体全基因组ATAC-seq谱的PCA结果表明，PB-Mono和BM-Mono处于同一主成分PC1；PB-MS1和BM-iMS1在PC1是两个不同的簇，但在PC2却是相似的（图a）。通过对PB-Mono和PB-MS1的差异峰进行富集分析，发现对单核细胞发育起关键作用的转录因子FOSJun、PU.1和CEBP富集（图b和c）。
考虑到这些转录因子在炎症诱导的骨髓生成过程中所起的重要作用，我们分析了CEBP转录因子的表达。在bulk-seq的数据分析中，PB-MS1和PB-Mono相比，有CEBPD、CEBPE表达增加，CEBPG表达减少的趋势；在BM-iMS1和BM-Mono的比较中也有类似的趋势（图d）。并且，分析骨髓祖细胞向iMS1细胞的分化轨迹也发现，从GMP状态过渡后CEBPD表达增加（图e）。
因此，MS1细胞具有明显不同于正常CD14+血液单核细胞的表观基因组特征，可能与单核细胞分化相关的转录因子有关。虽然体外培养的BM-iMS1不能完全再现MS1细胞的表观基因组特征，但两个种群在可达的峰值上有显著的重叠，并共享类似上调的转录因子。
七、MS1细胞对再刺激的功能反应最后，为了比较MS1细胞与其他CD14+单核细胞功能反应的区别，我们对上一张图中的四个单核细胞群体在静息24h后用ng/mL的LPS刺激。
作者发现LPS刺激导致细胞因子分泌相关基因的上调和NFκB信号通路的激活（图a）。
与PB-Mono相比，PB-MS1细胞的反应强度降低；而与BM-Mono相比，BM-iMS1细胞的反应强度降低，原因是肿瘤坏死因子（TNF）表达降低，TNF-α蛋白分泌减少（图b）。
通过分析刺激后差异表达基因的交集，可以发现在PB-MS1和BM-iMS1中NFKBIA表达量都上调表达，而NFKBIA是一种炎症反应抑制剂，这可能与PB-MS1和BM-iMS1被LPS刺激后反应迟钝有关（图c）。
由此表明，脓*症患者的MS1细胞和人骨髓中的MS1细胞对进一步的细菌刺激都有异常的反应，作者能够利用体外培养的方式重现脓*症患者中已知的单核细胞表型。
总结
这篇文章利用单细胞测序技术在脓*症患者体内发现了一种具有将患者与正常人区分开的MS1单核细胞状态，并且利用体外培养的方式提出并验证了由人类骨髓诱导产生iMS1单核细胞状态的模型。
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