文章：InvestigatingTransfusion-relatedSepsisUsingCulture-IndependentMetagenomicSequencing
发表期刊：ClinicalInfectiousDiseases
IF:8.
通讯作者：CharlesLangelier
通讯作者单位：UCSF/ChanZuckerbergBiohub
研究背景
血小板的细菌污染对公共卫生安全来说是一个重大的隐患，目前临床报道，大约每-个血小板单位中就含有一个可检测到的微生物。尽管血小板在临床输注前都会经过光灭活等手段处理，理论上可以广泛有效清除病原微生物，但在高细菌负荷的情况下，灭活也可能会不彻底。与其他血液制品相比，血小板在室温条件下容易滋生更多的细菌。环境中细菌是污染最主要的来源，皮肤菌群或者患有无症状菌血症献血者的血液也是潜在的污染源。目前与输血相关脓*症报道并不多，可能与患者在行微生物培养前就使用了抗生素相关，或者脓*症被归因于患者行血小板输注前就存在感染。因此，该研究描述和讨论了3例与输血相关的革兰氏阴性脓*症，病原结果经微生物学检验和宏基因组二代测序(mNGS)共同验证。
研究方法
微生物培养：分别对患者血液，输注残余的血小板和红细胞分离的微生物进行接种培养，并且使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Bruker)进行物种鉴定。
mNGS：使用IlluminaMiSeq或NextSeq进行测序。
数据下机后，借助IDseq平台对样本中微生物进行生物信息学、系统发育分析分类鉴定和丰度定量。
研究结果
病例一：不动杆菌败血症
患者A，59岁，患有复发性急性淋巴细胞白血病，接受化疗，第一次输注血小板后未出现副作用。然而，在接受第二次输注的2h后，出现寒战和僵硬，随后出现发烧和严重低血压。输血后4.5h的血培养结果为醋酸钙/鲍曼不动杆菌复合体（ACB）阳性。血小板袋盐水冲洗所获得的残留物也培养出ACB复合体和腐生葡萄球菌。然而来自同一供体的其他血液成分（与输注血小板同时行灭活处理）的培养结果为阴性。
为进一步研究该病例，对患者输血后血液和血小板残留物培养的ACB复合体进行测序和分析，发现了一个新的不动杆菌属物种，它与ACB医院不动杆菌和皮特不动杆菌关系最密切。
系统发育分析显示，输血后患者血液和血小板残留中发现的不动杆菌是完全相同的菌种。ACB复合体在血小板残留物和患者输血后血浆中检测到的含量很高，绝大多数不动杆菌属的序列与ACB复合体吻合。在输血前的样本中ACB复合体含量很低，而且只有部分不动杆菌属的序列能与ACB复合体匹配。结合同一捐献者的血小板外其他血液成分培养的阴性结果，表明ACB复合体的细菌污染只存在于输注的血小板和患者输血后的血浆。
病例二：输血引发的致死性铜绿假单胞菌感染
患者B，77岁，因急性和慢性心力衰竭而入院治疗，并植入右室辅助装置。手术期间，他接受了三个单位的血小板、三个单位的血浆和两个单位的浓缩红细胞(PRBCs)输注。术中，患者血液动力学变得不稳定。术后3小时血培养结果为铜绿假单胞菌阳性。尽管使用了抗假单胞菌抗生素，患者的临床稳定性继续恶化，术后第3天死亡。
回顾性地对输血前和输血后收集的患者血浆样本、血培养瓶样本以及输血后残留的PRBCs进行mNGS（输注使用的血小板或血浆没有剩余，无法进行mNGS或细菌培养）。结果显示：输血前血浆样本和残留的浓缩红细胞中未发现铜绿假单胞菌，然而在输血后血浆中发现了高度丰富的铜绿假单胞菌，通过抗生素的治疗，铜绿假单胞菌的含量随着时间的推移而下降。
病例三：血小板输注引发的致死性克雷伯菌败血症
2名免疫缺陷儿童患者在输注同一捐献者的血小板后发生感染性休克。患者C成功接受了自体造血干细胞移植，在输血15分钟后出现低血压、心动过速和呕吐。尽管经过急救和抗生素治疗，患者仍在5小时内死亡。患者血液和血小板袋中残留物的培养结果均显示肺炎克雷伯菌阳性。患者D在输血前，接受了经验性头孢吡肟治疗中性粒细胞减少症。在输血9小时后，失代偿进入感染性休克，最终在液体复苏和血管加压药治疗下生存。在接受抗生素治疗的同时，抽取的血液细菌培养为阴性。
通过mNGS对输血前后的血浆或血清样本进行检测，两名患者输血后肺炎克雷伯菌浓度显著增加，血培养为阴性的患者D测序得到的肺炎克雷伯菌rpM值比患者C低12.9倍。
D患者没有残留的血小板可以用来进行培养和mNGS检测，但D患者的血浆样本和C患者包括血小板残留物在内的三个样本都检测出属于同一菌株的肺炎克雷伯菌，证明两位患者的感染都源自同一捐献者的血小板。
结论
在病例1中，考虑血小板的污染包括病原体灭活失败、环境污染、或患者此前存在隐匿性菌血症导致输血过程中体内细菌进入血小板袋内。通过mNGS检测，证实污染发生在灭活处理后，有可能来自样本运输或储存过程中的环境污染。此外，还发现一种新的不动杆菌，突显了mNGS对于非特定微生物的检测能力。在病例2中，尽管输注所用的血小板或血浆没有剩余无法进行mNGS或细菌培养，但是通过对输血前后采集的血浆样本的检测发现，只有在输血后才检测到铜绿假单胞菌，说明这仍然是一例由输血引发的败血症。病例3，尽管输血后发生败血症休克，但患者D的血培养仍为阴性。患者D正在使用一种对肺炎克雷伯菌有活性的预防性抗生素，会抑制细菌在培养中的生长。而不依赖培养的mNGS不仅证实了两名患者血液中存在肺炎克雷伯菌，还证实了它与输注血小板产品中的分离株相同，表明了两位患者的感染来自同一捐献者的血小板。
对比mNGS和细菌培养在本次研究中的应用，mNGS可以在不到48小时内准确的完成病原体的鉴定分析，比血液培养的周期更短，且不依赖于培养，可以对某些不适用于培养的临床样本进行分析。通过宏基因组测序可以直接对临床标本输血前后病原体丰度进行纵向评估，为研究输血相关脓*症提供了更好的方法，并且对调查和预防输血相关的感染提供了有效帮助。随着宏基因组测序方法在输血相关感染研究中的应用越来越广泛，通过开源数据库快速交换病原体基因组信息，可以加速相关病例的识别，加强对新爆发疫情的感染控制工作。
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