导读
炎症性肠病（IBD）包括克罗恩氏病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），是以肠道炎症为特征的慢性病。已知，黏附侵袭性大肠埃希菌（AIEC）的致病力越来越与IBD的发病机制紧密相关，同时卡拉胶（CG）可用于诱导断奶仔猪的结肠炎。本研究对实验性模型断奶仔猪进行AIEC菌株UM接种和为期21天的CG喂食，观察肠组织中食糜和炎性细胞因子的短链脂肪酸水平和肠道菌群变化情况。
文献ID
题目：CarrageenanGumandAdherentInvasiveEscherichiacoliinaPigletModelofInflammatoryBowelDisease:ImpactonIntestinalMucosa-associatedMicrobiota
译名：乳猪IBD模型中的卡拉胶与黏附侵袭性大肠埃希菌对肠道粘膜相关菌群的影响
期刊：FrontiersinMicrobiology
时间：-03-21IF=4.
通讯作者：EhsanKhafipour;Jean-EricGhia
通讯单位：医院研究所
材料与方法
实验设计
1、研究对象
断奶雄性仔猪，进行为期21天的生物学实验。所有仔猪采用自由饮食，3天适应期后开始实验。
2、实验组的设定
共设立4组研究对象，分别是：（1）对照组；（2）CG；（3）AIEC菌株UM；（4）UM+CG。第2组和第4组乳猪从第1天起摄入含有1%CG的饮用水，第3组和第4组乳猪在第8天接种UM。
表1.CG和UM添加情况表
3、粪便类型划分
根据腹泻严重程度对粪便进行划分。划分标准：0，正常；1，软粪；2，轻度腹泻；3，严重腹泻。
4、组织和食糜取样
组织样本（两个5厘米长）取自回肠、盲肠和升、降结肠，用无菌生理盐水冲洗去除多余管腔内溶物后放入液氮冷冻，?80℃保存，用于DNA提取和后续生理/微生物水平分析。
5、pH、氨态氮和挥发性脂肪酸（VFA）分析及炎症反应
使用AccumetBasic15pHmeter进行pH测定，使用量热技术进行氨氮浓度测量，采用气相色谱法进行VFA测定。细胞因子水平和肿瘤坏死因子[(TNF)-α]用custommesoscaleporcinekit进行测定。
6、相关性分析
关联分析中，相关系数和P值及所产生的相关矩阵均通过R语言corrplot包生成。
7、Illumina测序
利用改良的引物F/R对16SrRNA基因V4区进行扩增。构建好的文库利用IlluminaMiSeq平台进行bp双末端测序。
8、生物信息学分析
去除所有低质量序列和重叠区域多余碱基。输出的fastq文件利用开源软件包QIIME下游路径进行分析。组装片段解码和嵌合片段过滤后的序列被分配到操作分类单元（OTU）。使用RDP对每个OTU代表性序列进行分类，用pynast算法将其与参考数据库比对。利用FastTree2.1.3构建进化树。α多样性指数使用SASMIXED程序计算P值。。采用BrayCurtis相似矩阵生成非度量多维标度（NMDS）排序图进行菌群β-多样性（β-diversity）分析。置换多元方差分析（PERMANOVA）和P值用于统计组间菌群β-多样性差异。使用PICRUSt，参考Greengenes(v.13.5)数据库对16SrRNAgene测序数据进行菌群功能预测分析。利用STAMP对KEGG进行统计分析。
测序区域及平台
16SrDNAV4区，lluminamiseqpe;
研究成果
1、接种UM后的腹泻程度
接种后48h，除CGUM组外，其它仔猪均未发生腹泻（图1a）。接种后96h，UM组仔猪产生软粪（粪便类型划分：1.5），其它组仔猪出现轻度腹泻（粪便类型划分：2.5）。
图1.对断奶仔猪进行CG饮食和UM接种后，大便硬度及炎症标志物（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、与TNF-a）的变化。
2、回肠、盲肠和结肠中的VFA、氨氮及pH值水平
如表2所示，UM组仔猪，除盲肠中的氨氮水平较对照组低外，回肠和结肠中水平与对照组相似，回肠、盲肠及结肠中的PH值也与对照组相近。各组仔猪回肠中的VFA浓度相似。CG组仔猪盲肠和结肠中的丁酸盐水平显著低于UM组，但和其它组没有显著差异。此外，CG及CGUM组仔猪的结肠乙酸水平较对照组显著降低，与UM组无显著差异。
表2.对断奶仔猪进行CG饮食和UM接种后，回肠，盲肠和结肠粘膜的微生物活性水平。（包括pH值、铵氮及VFA水平等）
3、回肠、盲肠、升结肠和降结肠中的炎性细胞因子水平
第21天，4个肠段的细胞因子水平，CGUM组仔猪，降结肠和回肠中的IL-8和IL-6水平均上调，UM组仔猪降结肠中的IL-10水平上调。每组仔猪4个肠段的IL-1β、TNF-α水平均无差异（图1B–F）。
4、相关系数及不同肠段的α-多样性
如表3所示，回肠、盲肠和升结肠的细菌分类群与各种短链脂肪酸和/或炎性指标呈正或负相关。回肠菌群多样性组间无显著性差异。与对照组和和UM相比，CG组和CGUM组仔猪的盲肠、升、降结肠中大多数的微生物多样性指数降低。
表3.CG组(1)和UM组(2)仔猪回肠，盲肠，升、降结肠黏膜菌群的α-多样性指数
5、仔猪回肠、盲肠、升、降结肠的菌群β多样性差异
如图2A–D所示，各处理组中，盲肠（p=0.）和降结肠（p=0.）间菌群具有显著性差异。CG和UM组仔猪的盲肠和降结肠菌群落组成不同。成对比较中，对照组与CGUM组（p=0.）、UM组与CG组（p=0.）仔猪的回肠菌群多样性差异不显著（回肠，p=0.；升结肠，p=0.）。UM组与CGUM组仔猪的升结肠的菌群多样性差异显著（p=0.）。
图2.喂食卡拉胶和接种AIEC的断奶仔猪各肠段菌群的非度量多维尺度（NMDS）分析。
（A）回肠；（B）盲肠；（C）升结肠；（D）降结肠。
6、门水平和较低层次分类水平上，不同肠段的菌群组成
回肠
经过滤共得到条序列，平均每个样本11,条。门水平上，所有样本分类共得到14个物种。厚壁菌门是优势菌，但相对丰度在各处理组间无显着性差异（图3a）。门以下的水平上，OTUs被分成类，其中95个分类的相对丰度≥0.01%，96个分类的相对丰度＜0.01%（相对丰度0.01%的物种被认为是丰富物种）。利用PLS-DA对相对丰度0.01%的分类进行鉴别以得到不同处理组中最具特点的物种分类群，结果详见（图4A、B）。
图3.喂食卡拉胶和接种AIEC的断奶仔猪各肠段粘膜门水平菌群的相对丰度。
（A）回肠；（B）盲肠；（C）升结肠；（D）降结肠。
图4.和不同组仔猪的回肠粘膜正/负相关的细菌分类群。
（A）对照组或接种AIEC的UM组仔猪，（B）CG组或同时喂食卡拉胶和接种AIEC的CGUM组仔猪
盲肠
经过滤共得到条序列，平均每个样本条。门水平上，所有样本分类共得到16个物种。其中，CG组仔猪拟杆菌门的相对丰度较对照组和UM组低（p=0.）,但和CGUM组无差异（图3B）。门以下的水平上，OTUs被成类，其中76个分类的相对丰度≥0.01%，其余均＜0.01%。利用PLS-DA对相对丰度0.01%的分类群进行细菌鉴别以得到不同处理组中最具特征的物种分类群，结果详见（图5A、B）。
图5.和不同组仔猪的盲肠粘膜正/负相关的细菌分类群。
（A）对照组或接种AIEC的UM组仔猪，（B）CG组或同时喂食卡拉胶和接种AIEC的CGUM组仔猪，
升结肠
经过滤共得到条序列，平均每个样本条。门水平上，所有样本分类共得到20个物种。其中，与对照组和UM组仔猪相比，CG组和CGUM组仔猪的厚壁菌门相对丰度较低（p=0.），而变形菌门（p=0.）和脱铁杆菌门（p=0.）相对丰度较高。CG组仔猪的拟杆菌门与UM组相同，相对丰度较其他组低（p＜0.0）（图3C）。门以下的分类水平上，OTUs被分为类，其中81个分类的相对丰度≥0.01%，个分类的相对丰度＜0.01%。利用PLS-DA对相对丰度0.01%的分类群进行细菌鉴别以得到不同处理组中最具特征的物种分类群，结果详见（图6A、B）。
图6.和不同组仔猪的升结肠粘膜正/负相关的细菌分类群。
（A）CG组或同时喂食卡拉胶和接种AIEC的CGUM组仔猪，（B）对照组或接种AIEC的UM组仔猪
降结肠
经过滤共得到条序列，平均每个样本条。门水平上，所有样本分类共得到17个物种。最丰富的门类中，CG组、CGUM组仔猪与对照组相比，厚壁菌门（p=0.）和支原体（p=0.）的相对丰度均降低，但它们的相对丰度和UM组仔猪无差异。CG组仔猪和其它组相比，变形菌门的相对丰度显著升高（p＜0.0），拟杆菌门相对丰度显著降低（P＜0.0）（图3D）。门以下的分类水平上，OTUs被分为类，其中84个分类的相对丰度≥0.01%，97个分类的相对丰度＜0.01%。利用PLS-DA对相对丰度0.01%的分类群进行细菌鉴别以得到不同处理组中最具特征的物种分类群，结果详见（图7A、B）。
图7.和不同组仔猪的降结肠粘膜正/负相关的细菌分类群。
（A）CG组或同时喂食卡拉胶和接种AIEC的CGUM组仔猪，（B）对照组或接种AIEC的UM组仔猪
7、微生物的功能基因组
OTU的比对情况是：回肠96.7%，盲肠91.4%，升结肠88.1%和降结肠85.7%（所有的组织的平均比对率是90.5%）。如图8所示，果糖和甘露糖代谢、氨基糖，核苷酸糖代谢、核糖体发生，DNA复制蛋白，DNA修复和重组蛋白等不同的代谢途径在UM组仔猪升结肠粘膜菌群中富集。包括但不限于细菌趋化性、鞭毛组装和脂多糖生物合成蛋白质等的功能通路在CG或CGUM组仔猪升结肠粘膜菌群中富集。如图9所示，包括但不限于转运蛋白、转录因子、DNA修复和重组蛋白、淀粉和蔗糖代谢等的功能通路在对照组仔猪降结肠黏膜菌群中富集。此外，分泌系统，鞭毛组装，细菌分泌系统，和脂多糖生物合成蛋白等功能途径也在CG或CGUM组仔猪降结肠粘膜菌群中富集。对照组仔猪的升、降结肠粘膜菌群的pathway无差异，UM组也一样。对照组和UM组仔猪回肠和盲肠的粘膜菌群pathway也无显著差异。
图8.仔猪升结肠粘膜组间比较，富集或减少的子系统和途径通路。
（A）UM组vsCG组，（B）UM组vsCGUM组
图9.仔猪降结肠粘膜组间比较，富集或减少的子系统和途径通路。
（A）对照组vsCG组，（B）对照组vsCGUM组
研究结论
CG诱导的结肠炎可降低细菌物种丰度，同时改变菌群组成。与对照组及UM组仔猪相比，CG和CGUM组仔猪肠道菌群在门水平上，变形菌和脱铁杆菌增加，厚壁菌、放线菌和拟杆菌减少，且结肠菌群的代谢能力也发生改变。CG可诱导菌群失调和群落组成改变，这和IBD患者的情况相似。然而，单一接种UM的仔猪肠道菌群无明显变化。
亮点
①研究结果表明，使用1%的卡拉胶可诱发结肠炎，引起肠道菌群失调，盲肠、升、降结肠粘膜的厚壁菌门，拟杆菌门、变形菌门的相对丰度明显改变，细菌多样性也发生显著变化。
②UM未能引起健康实验对象内肠道菌群失调。
③本研究同时选取回肠、盲肠、升、降结肠等4个肠段作为研究对象，取材全面，结果具有说服力。
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供稿：李亚丽
编辑：王霞
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