摘要：为确诊引起*某基层团场长途调运西门塔尔后备母牛发病死亡的病因，通过临床剖解，结合常规细菌分离鉴定、PCR检测，对发病肉牛进行现场诊断和实验室检测确诊，证实引起此次西门塔尔肉牛发病死亡的主要原因是长途运输诱发的应激综合征，主要致病菌为巴氏杆菌和支原体，并伴有附红细胞体混合感染。针对病因和药敏试验结果，采取了抗菌消炎和对症治疗等措施，发病死亡情况由此得到有效控制。此病例的诊治为*地区长途调运牛只时，降低类似事件的发生提供了一定的理论基础和实践指导。
肉牛运输应激综合征（transportstresssyndromeofbeefcattle，TSSBC）俗称“烂肺病”，是指因长途贩运过程中出现多种应激原，如热、冷、风、雨、饥、渴、挤压、惊吓、颠簸、合群、调料、体力耗费、环境改变、潜在疾病等，导致机体抵抗力下降，病原微生物，如支原体、巴氏杆菌、肺炎球菌、大肠杆菌等趁虚而入，引起呼吸道、消化道乃至全身病理性反应的综合征候群，如体温升高、精神沉郁、食欲减退、被毛粗乱、咳嗽、气喘、流黏性或脓性鼻液、拉稀、血便、关节炎、结膜炎、极度消瘦，甚至衰竭死亡。在没有专业指导和提前预防的情况下，不同地区间调运的牲畜，经过长途运输到达目的地后，由于运输过程的多样性、复杂性等，会出现不同程度的发病。
年*兵团第十师某基层团场购自东北地区某地的12~14月龄西门塔尔后备生产母牛到场3~5d后集中发病，主要临床表现为体温升高（41.2~41.7℃）、精神沉郁、流涎、食欲废绝、反刍停止，继而腹痛、下痢、干咳、腹式呼吸，牛只临死前体温下降、呼吸困难；病程较短，一般为3~5d，发病率为25.11%（/），病死率为81.65%（/），多数为急性死亡，治愈牛只多数后期生长不良。本研究应用常规细菌分离鉴定、分子生物学技术和血清学技术，明确引起长途运输肉牛发生不明原因大规模死亡的病原因素，掌握运输应激诱发动物发病的临床特点和致病特性，为后续制定综合防控措施提供技术支撑和实践指导。
材料与方法
材料
病料与标准菌株。无菌采集病死牛心血、肺脏、肝脏、淋巴结等病料，-20℃冷冻备用。
引物合成。参照Townsend等、Hoelzle等、韩猛立等、徐淑菲等的方法，合成多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida，Pm），牛支原体（Mycoplasmabovis，M.bovis），牛病*性腹泻病*（bovineviraldiarrheavirus，BVDV），牛传染性鼻气管炎病*（bovineinfectiousrhinotracheitisvirus，IBRV）的扩增引物。引物序列及扩增片段大小见表1。
方法
解剖和染色镜检。剖检病牛，将病料组织触片，如心血、肺脏、肝脏，分别进行革兰氏和瑞氏染色镜检，观察其形态特征。
分离培养。将无菌采集的病死牛心血、肺脏、肝脏组织样品分别接种于营养肉汤，37℃恒温培养16~20h后，再接种于麦康凯琼脂平板、5%绵羊血琼脂平板，37℃培养18~24h，观察不同培养基上的生长情况、菌落形态及溶血情况。
生化鉴定。挑取典型菌落进行分离纯化，联合应用常规生化鉴定与全自动微生物生化鉴定系统鉴定。
支原体和相关病*PCR鉴定。将肺脏组织参照文献报道的办法进行前期处理，应用PPLO固体培养基进行培养，挑取典型菌落进行特异性PCR扩增；对采集的病牛血液参照文献中的方法进行BVDV、IBRV的PCR检测。
药敏试验。按照常规方法进行，使用杭州滨河微生物试剂有限公司生产的临床常用药敏纸片，采用纸片琼脂扩散法（K-B法）进行药物敏感性试验。
结果与分析
临床剖解
病死牛剖解病变主要表现为：肺部淤血肿大，呈暗红色（图1-A），切开后流出纤维素性浸出液，切面呈大理石状，部分出现胸壁粘连，肺心叶有多个*豆大、*白色坏死灶，胸腔积液；肝脏肿大，表面有灰白色坏死灶；胆囊显著肿大；心外膜、心冠脂肪有出血斑点，尤以心耳出血明显（图1-B）；淋巴结水肿、出血，肠道广泛性出血。
染色镜检
对采集的心血、肺脏、肝脏、脾脏组织涂片瑞氏染色镜检。从心血、肺脏涂片中发现单一的、两极浓染的球杆菌，可见明显的荚膜；心血涂片可见红细胞形态不规则，中间出现空洞，红细胞表面附着大量虫体，呈链状排列，红细胞呈星形（图2）。初步判定为，巴氏杆菌与附红细胞体的混合感染。
细菌鉴定
将从肺脏组织中分离到的菌落进行分离纯化，经全自动微生物鉴定仪鉴定，发现生化反应结果符合牛多杀性巴氏杆菌特性（可信度为99%），初步鉴定为牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida，Pm）；对分离纯化的菌落进行PCR特异性扩增，琼脂糖凝胶电泳，结果发现在bp处均出现与目的片段一致的条带（图3），测序结果与GeneBank数据库中多杀性巴氏杆菌同源性达99%以上。
支原体PCR鉴定
将肺脏组织应用PPLO固体培养基培养，可观察到煎荷包蛋样菌落。典型菌落的特异性PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳结果显示，获得了与预期大小一致的bp片段（图4），证明分离株为牛支原体；对阳性片段回收测序，发现分离株与牛支原体国际标准株PG45（GeneBank号CP）、地方株FJ-HJ株（GeneBank号KX）、HB株（GeneBank号CP）、CQ-W70（GeneBank号CP）16SrRNA基因序列相似性介于96.9%~98.5%。
IBRV和BVDV的PCR检测
病牛血液BVDV、IBRVPCR检测结果显示，未获得目的条带（图5），检测结果为阴性。
药敏试验
按照CLSI标准和配套的试剂盒操作步骤及判定标准，对分离菌株进行药敏试验。结果显示，分离菌株均表现出不同程度的耐药性：牛巴氏杆菌对环丙沙星、氟苯尼考、阿奇霉素、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶敏感，牛支原体对左氧氟沙星、阿奇霉素敏感，两种病原对临床普遍使用的青霉素、磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类等表现出全部耐药（表2）。
综合诊断及治疗
根据细菌学检验结果、病理解剖变化特征，结合现场发病情况、临床症状观察，以及牛只经长途运输的情形，判定此次牛只发病死亡系由长途运输导致牛机体免疫力下降，扰乱了牛机体的细胞免疫和体液免疫，继而混合感染巴氏杆菌（多杀性巴氏杆菌）、牛支原体和附红细胞体，引起急性败血症所致。对出现肺炎症状的发病牛只，按照抗菌消炎（结合市售兽药情况，选用泰乐菌素和环丙沙星）、解热镇痛，配合强心补液，提高机体免疫力和抗过敏的原则进行治疗，发现对处于发病期的牛治愈率不高，但对同群其余牛只治疗效果较佳。经过28d的处理和治疗，该牛群发病情况得到有效控制，没有新发病例出现。
讨论
为改善肉牛养殖品种，*建设兵团部分农牧团场相继从东北地区外购良种生产母牛，以解决肉牛产业发展缓慢的现状。此次大规模长距离外购生产母畜事件中，该场前期做了诸多准备，包括实地考察、挑选牛只、联系车辆、途中休息、饲养圈舍规划、饲料储备、技术人员安排等，但依然出现运输应激综合征，造成大量肉牛发病死亡，经济损失巨大。
近年来，牛肉需求量越来越大，导致许多地区肉牛供给不足，需要从外地经长途运输引进。而运输应激综合征严重影响了我国肉牛产业的健康发展。动物在运输过程中，遭遇驱赶、装卸、震动、拥挤、噪声、温湿度变化、禁水限食、疲劳等持续强烈的刺激后，会出现运输应激综合征，导致机体生理机能紊乱，抵抗力下降，此时病原微生物趁机侵入宿主体内，会引起动物发病死亡。据国内学者报道：长途运输引发肉牛运输应激综合征的发病率约为80%，病死率达40%以上；在牛群转运过程中，运输应激常诱发以牛支原体肺炎为主的传染性疾病，发病率在80%以上，病死率达10%以上，严重的甚至高达40%~60%，可造成巨大的经济损失。
国外学者认为：运输集装箱卡车设计、储存密度、驾驶员驾驶技术、道路质量、通风情况和环境温度是评估运输条件时需要考虑的容易引起运输应激综合征的重要因素；运输过程中发生的生理变化始于脱水、饲料摄入不足、组织损伤、吸入烟雾以及生理和心理压力。国外学者已开展了运输应激对鼻咽部微生物群、皮质醇、中性粒细胞、机体免疫应答、急性期蛋白以及基因表达等多方面的影响。而国内研究主要集中在病例分析、生理指标和生化免疫指标、对应激蛋白与miRNA的影响、综合防治和抗应激处理技术等方面。
Moore等分析了—年自澳大利亚运往中东、俄罗斯和中国的20次活牛长途运输中头牛死亡的病因：最主要的是呼吸道疾病（59.4%），其次是跛行（12.2%）、酮病（6.7%）、败血症（6.1%）和肠道疾病（5.6%）；2/3的病牛肺组织有病变，其中72%发生细菌感染，3%发生病*感染，22%发生细菌、病*混合感染，3%原因不明；相关病*主要是牛冠状病*、疱疹病*Ⅰ型、病*性腹泻病*、呼吸道合胞体病*和副流感病*3型等，其他病原微生物主要有支原体、睡眠嗜组织菌、溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌等。
国内研究发现：肉牛运输应激综合征常表现为呼吸道疾病，其次为腹泻和关节肿胀；感染病原主要为支原体和巴氏杆菌。姚永进等、杨铭伟等在*石河子、博乐、奎屯、塔城等地区牛场因肺炎死亡的犊牛肺脏组织中，分离获得牛支原体，但多数分离自犊奶牛及3月龄内的乳用犊牛；张锐等确诊*北屯市某牛场新引进肉犊牛发生肺炎死亡的病原为牛支原体，推测可能与牛群发病前的长途运输应激有关，说明运输应激不仅可诱发牛巴氏杆菌病，也可导致牛支原体肺炎暴发。由此可见，牛引种运输需要重点加强呼吸道疾病的管理与处置。
为降低运输应激对肉牛健康的影响，需要综合考虑运输的整个过程和环节，如运输前根据牛群基本情况和自身需要挑选高品质健康肉牛，不能从疫区引进肉牛，有条件的可以进行主要疫病的流行病学调查；引进后加强饲养管理与保健，提高动物机体免疫力和体抗力，防止病原微生物入侵；提前改变饲喂方式，以适应长距离运输需要，做好环境和车辆的消*等。运输过程中需要注意车辆的选择以及车速、路线规划、中途休息与饲喂、装车密度、运输时间和季节、安全防护与病牛治疗等。到达目的地后要小群饲养，隔离观察，做好过渡期的饲养管理和营养需求，注意保持牛舍卫生清洁、通风和消*，待动物体况稳定并进行驱虫后，再混群饲养。当肉牛出现运输应激综合征时，应先隔离病牛，对污染的圈舍、垫料、用具和受威胁的牛群进行消*处理，同时进行临床诊断和实验室检测，查明发病原因，采取对因治疗和对症治疗。建议推广实施“自繁自养”模式，扩大肉牛基础母牛群，增加各地尤其是传统优势地区能繁母牛的存栏量。
结论
通过现场调查，结合临床症状、临床剖解和发病情况，初步诊断此次大规模外购生产母畜到达目的地后发病死亡的原因是长途运输引起的应激综合征；经实验室细菌分离鉴定和分子生物学检测，确定引发应激综合征的主要致病菌为巴氏杆菌和支原体，并伴有附红细胞体的混合感染；对症治疗、抗菌消炎、提高机体免疫力和抗过敏的治疗原则，对发病中后期牛群的治疗效果不佳，但对同群其余牛效果显著。此病例的诊治，为长途调运生产母畜时，降低类似事件的发生提供了一定的理论基础和实践指导。
《肉牛长途运输诱发应激综合征的诊治》详情