血液感染仍然是重症监护室的主要挑战之一，在许多病例中会导致脓*症甚至感染性休克。由于当前诊断方法的时效性差、灵敏度低，使得败血症的死亡率仍然很高。早期明确病原微生物对于改善血液感染的结果至关重要。德国FraunhoferIGB的学者开发了一种通过测序分析血浆中游离DNA准确检测脓*症患者病原体的方法，研究成果发表在TOP期刊《GenomeMedicine》。
◆研究背景
脓*症仍然是重症监护医学中的难题，其发病率在过去的几十年里不断上升。病原菌的鉴定及其耐药模式对早期优化抗菌治疗方案至关重要。在这种情况下，基于培养的诊断（如血培养）具有明显的局限性：(i)培养时间长;(ii)结果易受抗生素影响。因此，脓*症患者因广谱抗生素的长期使用，极易出现抗生素过度治疗、抗生素相关*性以及多重耐药病原体。
基于PCR的诊断方法总体上灵敏度仍较低，病原体定量和耐药信息不全面。因此，本研究通过使用下一代测序(NGS)对脓*症患者血浆样本中的循环无细胞游离DNA(cfDNA)进行无偏序列分析，开发了感染性微生物的替代诊断平台。此外，本研究还证明NGS用于检测血浆中抗生素耐药性标记物的适用性。
◆研究方法
样本：医院外科重症监护室的例患者，其中脓*性休克患者60例，腹部大手术后无任何感染迹象的术后对照30例以及健康自愿者30例。方法：分别于脓*症发作(T0)、24h(T1)、4d(T2)、7d(T3)、14d(T4)、28d(T5)收集脓*症休克患者血浆。术后组分别于术前(T0)、术后即刻(T1)和术后24h(T2)采集血浆样本。志愿者组血浆标本采集1次(T0)。对脓*症期间的血培养测试结果进行回顾性筛查，并根据相似时间点的微生物数据选择患者。对上述样本进行常规检测如血液培养，并分析阳性培养物；通过实时定量PCR对样本中的HSV1DNA和巨细胞病*DNA进行定量；对样本进行cfDNA宏基因组（mNGS）建库测序分析，去除宿主DNA和背景微生物后得到病原微生物信息；最后，对常规检测结果、mNGS结果和临床结果的吻合度进行系统性评估。
◆研究结果
1、脓*症患者cfDNA水平升高揭示微生物DNA片段为了测试cfDNA在脓*症患者中病原微生物的诊断潜力，对脓*症患者（S，N=7）、健康志愿者（V，N=12）和接受腹部手术未被感染的患者（P，N=6）的62例血浆样本进行了分析。脓*症患者采用全面的临床微生物学诊断检查。cfDNA浓度在脓*症休克患者中有升高的趋势，尤其是在脓*症发病时。与术前未感染的对照组和健康志愿者相比，术后患者的血浆浓度也有所升高。
图1.cfDNA浓度在不同患者组和时间点的分布
2、建立SIQ评分作为病原体定量评分
图2A总结了与未感染对照相比感染患者微生物reads数诊断评估的原则。计算每个血浆样本分类的、非人类的reads数的归一化计数，得出不同物种的量化结果；S9患者在脓*症血培养阴沟肠杆菌阳性时，归一化后发现阴沟肠杆菌reads数明显高于背景物种（图2B）；为了评估所有分类物种的reads丰度的意义，对所有感染性疾病患者和对照组的每种物种的归一化reads数进行比较；除S9患者的T0时间点外，患者和对照组阴沟肠杆菌归一化后的丰度接近零（图2C）；相比之下，在所有样本中，痤疮丙酸杆菌等常见皮肤共生菌的归一化reads数差异显著，特别是在未感染对照样本中检测到较高的丰度（图2D）；为了支持相关性的区分，我们将样本中发现的每个物种的reads的丰度和不可能性结合起来。归一化的读数取log2绘制1-p图表（图2E）。
图2.SIQ评分和SIQ图的基本原理
3、SIQ评分的临床相关性SIQ评分还可用于对患者的病情进展和对靶向治疗的反应进行时程监测。研究将SIQ评分与临床微生物学数据进行了比较，并补充了试验期间的抗感染治疗数据。患者S10在接受胃切除术后，因严重肺炎出现感染性休克（图3A）。血浆样本测序结果显示，在所有观察时间点，患者血液中微生物以金*色葡萄球菌为主，SIQ评分为.24、.41、12.86、2和0.03。有趣的是，金*色葡萄球菌的SIQ评分最高也是在纳入后一天，之后明显下降。第7天，HSV1病*的SIQ评分最高（43.07分），第14天也在呼吸道分泌物中检测到该病*，其他样本均未检测到。
图3.两名患者的常规临床微生物学数据与SIQ比较
患者S60（图3B）反复出现肠漏，并伴有并多次脓*症，反复接受了腹部重建手术。该患者血浆的SIQ评分分析在整个时间过程中与非血培养的临床微生物学结果高度一致。在脓*症早期（0、1、4、7、14和21天）收集的样本证实临床表现为由大肠杆菌、屎肠球菌和脆弱拟杆菌引起的多种微生物腹腔感染。
图3.两名患者的常规临床微生物学数据与SIQ比较
4、抗性基因鉴定
研究分析了一例肝移植后并发脓*症的59岁女性患者的血样。对相应的血浆cfDNA进行高深度测序发现屎肠球菌基因组被均匀覆盖（图4A），并在CARD数据库中发现了明确的抗性基因（图4B）。因此，cf-mNGS还可以用于抗性标记物的鉴定。
图4.感染万古霉素耐药屎肠球菌的患者的基因组覆盖率和耐药性概况
◆总结
1、血浆样本中来自微生物的细胞游离DNA（cfDNA）水平可以准确地反映感染的动态;2、cf-mNGS适用于对血流感染进行无偏倚分析，尤其适用于传统微生物或分子诊断方法失败的病例。
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医院合伙人：--
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