作者：刘婷石华刘芳江咏梅
新生儿感染性疾病（neonatalinfectiousdiseases，NIDs）是新生儿死亡的主要原因，占全球每年死亡新生儿的约29%[1]。细菌、病*、真菌、支原体、衣原体和寄生虫等病原体感染新生儿可导致局部或全身性的炎症，重度感染可导致新生儿肺炎、化脓性脑膜炎和新生儿败血症等。该病临床表现多样，早期没有特异性，且进展迅速，致死率高，严重危害新生儿的生命健康。早期、快速、准确的诊断出感染病原体，有助于临床医生选择合理的抗生素进行有针对性的治疗，进而有效提高危重患儿的生存率和改善预后。目前新生儿感染病原体的实验室诊断主要面临四大挑战：（1）新生儿作为一个特殊的群体，免疫系统发育尚未完全，机体防御能力低下，因此导致其感染的致病因素较成人更为复杂，且容易合并特殊病原体的感染。LaRosa等[2]认为新生儿体内细菌的总体组成在很大程度上聚集于3个纲，它们的分布与年龄较大的儿童或成人的细菌组成具有显著差异，例如在新生儿所有肠道细菌中，杆菌纲、丙型变形菌纲、梭菌纲分别占1%~5%、1%和45%~80%。（2）全球病原微生物感染呈现多样化和复杂化的趋势，新型冠状病*、H5N1禽流感和严重急性呼吸综合征等新发感染性疾病的不断出现给临床实验室病原体的筛查诊断带来了巨大的挑战，常规的诊断试剂盒并不包含这些新出现的病原体[3]。（3）针对新生儿感染病原体的传统实验室诊断主要以涂片染色形态学鉴定、微生物培养和抗原抗体检测为主，存在敏感度低、检测时间长和筛查目标单一的缺点。比如，脑脊液和血液培养，由于这类样本中存在的病原体丰度普遍较低，其培养阳性检出率也极低，易漏诊，甚至是误诊。部分实验室可开展实时荧光定量PCR等分子生物学检测方法，但受限于可用于临床的试剂盒种类，总体阳性率仍然偏低，超过半数的感染病例最终无法找到明确的感染病原体[4,5,6,7]。（4）针对新生儿临床样本的采集也往往较为困难，受限于1次采集能够获取的样本量，实验室检验人员几乎不可能通过1份标本进行所有可能致病微生物的筛查。因此，传统的病原微生物检测手段已经很难满足当今新生儿感染性疾病的诊治需求。本文将对宏基因组测序技术在新生儿感染性疾病病原体检测中的应用进行阐述，旨在进一步揭示宏基因组测序在新生儿感染性疾病诊治中的重要作用和应用价值。
一、宏基因组测序技术
宏基因组测序（metagenomicnext-generationsequencing，mNGS）是基于高通量测序技术以及生物信息学分析对病原体进行基因测序的临床实验室诊断技术[8,9]。截至目前，该技术是临床应用最广泛的病原体高通量测序技术，对临床患者感染病原体的早发现和精准治疗有着极其重要的作用。相较于全基因组测序技术，其成本更低，耗时更短[10]。相较于16SrRNA基因测序技术，其检测范围更广，不仅可以针对细菌进行鉴别和分类，还可以检测病*、真菌和寄生虫等其他病原体[11]。宏基因组测序技术应用于新生儿感染性病原体的实验室诊断主要具有五大优势：（1）新生儿感染性疾病进展迅速，宏基因组测序技术能够同时检测几百万甚至上亿条DNA或RNA序列，精准高效地获得样品中全部病原微生物的序列信息，克服了传统病原体检测方法耗时长、检测通量小的缺点[12]。（2）新生儿感染性疾病致病因素复杂，宏基因组测序技术克服了传统微生物检测分析中绝大多数微生物难以培养的障碍，极大的拓宽了微生物检测的范围。（3）新生儿临床样本采集相对困难，而宏基因组检测所需样本量小，一次采集的样本可满足所有感染病原体的快速诊断需求。（4）新生儿感染早期病原体丰度相对较低，而宏基因组测序技术敏感度高，能够检测到样本中丰度较低的微生物。（5）新生儿感染易受机体自身免疫力和环境因素的影响，基于宏基因组测序可以分析病原微生物群体的多样性、丰度、分布、功能结构和进化关系，解读病原体与环境、宿主之间的相互关系。可以肯定的是，对于任何一种感染性疾病，早期诊断和及时有针对性的治疗都具有十分重要的意义。通过宏基因组测序，临床医生能够快捷、高效、全面的了解新生儿感染病原体的种类和丰度，并对患儿进行及时、积极、有效且有针对性的抗生素治疗，这不仅可以减少抗生素的滥用，还能有效提高临床新生儿感染患者的转归。
二、宏基因组测序技术在新生儿感染性疾病中的应用
1．细菌性感染：细菌性感染是新生儿感染性疾病中最常见的一种，如大肠埃希菌、无乳链球菌、金*色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和淋球菌等。随着抗生素的广泛使用，甚至滥用，新生儿细菌性感染的病原体构成越来越复杂。不同细菌的生长条件不尽相同，有的差异极大，甚至不能培养。临床上通过细菌培养来诊断新生儿细菌性感染存在一定的局限性：（1）细菌培养时间普遍较长，且受限于新生儿细菌感染的时间和丰度，培养的阳性检出率普遍较低，特别是血液和脑脊液等样本类型；（2）通过培养能够检测到的致病菌种类有限，部分细菌培养所需的条件苛刻，部分细菌在临床微生物实验室不能培养，容易发生漏检；（3）采样人员皮肤和环境中的细菌污染也可能造成细菌培养的假阳性，容易发生误诊[13]；（4）新生儿的多重感染常容易被忽视，对于不明原因发热新生儿的病原体检测更是临床诊断的难点[7]。因此，临床医生对新生儿细菌感染性疾病诊断的准确性和时效性都提出了更高的要求，不依赖于微生物培养的病原体诊断技术宏基因组测序得到了广泛的应用[12]。宏基因组测序应用于新生儿细菌性感染诊断的优势在于：（1）检测无需预判感染病原菌的范围，一次实验便可以检测目标样本中几乎所有的病原体，且不存在一代测序方法中的偏倚性。Shaw等[14]研究了早产儿迟发性血流感染的临床特征和胃肠道微生物菌群特征，结果表明胃肠道是迟发性血流感染致病菌的寄生部位，病原体通过上皮屏障转移致病，如高丰度的葡萄球菌属和肠杆菌科。Laguna等[15]对囊性纤维化患儿肺泡灌洗液菌群进行了测序检测，结果证实链球菌、伯克菌、普氏菌、嗜血杆菌、卟啉单胞菌属以及伟荣球菌在囊性纤维化患儿肺泡灌洗液菌群中相对丰度较高。在这些研究中，研究者均未对感染相关的病原菌进行预判，而是经过客观的实验数据分析得出结论。（2）宏基因组测序分析有助于提高细菌性感染的阳性检出率，累积的研究数据表明宏基因组测序对病原菌的阳性检出率是传统培养方法的2.4倍[16]。（3）新生儿感染的发病机制有别于儿童或者成人，宏基因组测序的检测结果可以为新生儿感染机制的研究提供新的思路。坏死性小肠结肠炎在早产儿中致死率高达30%~40%。Ward等[17]通过宏基因组测序发现大肠埃希菌在早产儿肠道内定植时极易诱发坏死性小肠结肠炎，而在儿童和成人肠道内定植则通常不会引起任何症状。这一研究成果为坏死性小肠结肠炎的早期预防和治疗提供了理论依据。（4）某些感医院中引起大规模的流行，在感染性疾病发生院内感染后可采用宏基因组测序对引起感染性的病原体进行检测，以确定病原菌爆发的传播链[18]。Martineau等[19]基于测序技术对新生儿重症监护室黏质沙雷菌感染的爆发进行了调查研究，研究内容包括样品中细菌微生物群落和沙雷菌属相对丰度的评估以及沙雷菌菌株分型，结果证实环境样品中高丰度的黏质沙雷菌与新生儿感染密切相关。2．病*性感染：病*性感染也是新生儿感染性疾病中常见的一种，其中又以病*性呼吸道感染和中枢神经系统感染最为常见[20]。临床实验室对于病*感染的检测，目前主要以抗原抗体和特异性分子PCR检测为主，如免疫荧光检测和实时荧光定量PCR检测。免疫荧光检测操作简单，价格相对便宜，但结果不能长期保存，且受限于已有的抗体种类，能够检测的病*种类有限。而大多数的实时荧光定量PCR检测只能做单个病原体的检测，即便目前出现了多重PCR的病原体检测方案，所涉及的病原体种类也非常有限，因此一些不常见或有突变的病原体常会被漏检。宏基因组测序应用于新生儿病*感染诊断的优势在于：（1）宏基因组测序不依赖于目的病原体引物序列进行检测，所以该技术不仅可以快速鉴定样本中常见的病原体，还可以高效发现各种罕见及未知的病原体类型[21,22]。特别对于新生儿多重感染、少见感染和罕见感染的疾病诊断具有重要的意义。据报道Chen等[23]通过宏基因组分析对肺炎患者支气管肺泡灌洗液进行了分析，进而快速鉴定出了新型冠状病*。Piantadosi等[24]对1例经常接触蜱、啮齿动物与蝙蝠的严重进行性脑炎患者进行宏基因组测序分析，结果发现导致其致病的主要病原体为罕见的博瓦桑病*。（2）宏基因组测序以特定的微生物群落为研究对象，有利于医生解读特定区域微生物群落的特征及其与疾病发生发展的关系。Perez等[25]基于宏基因组测序技术研究了鼻病*感染过程中早产儿和足月儿的鼻咽微生物菌群差异，结果发现与足月儿相比，早产儿鼻咽微生物菌群具有很高的异质性。这些早产相关的微生物菌群特征在鼻病*感染过程中持续存在，表明新生儿的鼻咽微生物菌群在调节病*感染期间气道炎症和呼吸道症状方面起着关键作用。Moran等[26]利用宏基因组测序检测了不同年龄阶段的囊性肺纤维化患者的痰液样本，结果证实病*在该微生态中仅占1%左右，又以腺病*和疱疹病*为主要病*类型。3．真菌性感染：由真菌感染引起的孕产妇阴道炎是一种常见的妇科疾病，尤其是妊娠晚期的产妇患病率最高，容易导致新生儿的真菌感染，如念珠菌和曲霉菌等。通过宏基因组测序技术对妊娠晚期产妇的阴道进行微生态检测，能够全面了解孕产妇生殖道的病原体组成和丰度，为围产期抗生素的及时以及合理应用提供科学的参考依据，减少新生儿真菌感染的发病率和死亡率，有效提高社会效益和经济效益。宏基因组测序应用于新生儿真菌感染诊断中的优势在于：（1）新生儿感染的微生物群落环境复杂，多重感染的病原菌之间可能存在拮抗作用，宏基因组测序对于分析感染微生物群落结构有重要的意义。（2）临床上通过普通分子PCR的方法鉴定真菌感染十分困难，究其原因主要是真菌核酸分离纯化的产量差异很大。真菌除细胞核DNA外还具有线粒体DNA，部分菌丝可能缺乏细胞核。另外，真菌本身存在肥厚的荚膜，在核酸提取过程中，真菌破壁不充分会直接影响所得真菌核酸含量[12]。因此，在进行真菌感染普通PCR检测时选择合理的核酸提取方法尤为重要。而宏基因组测序技术对于样本上机检测起始核酸含量的要求不高，其检测敏感度显著提高，能快速、准确地对真菌进行鉴别和分型，甚至还可以获得细胞内多种生物催化剂酶的特征信息。4．其他感染：除了细菌、病*和真菌之外，感染性疾病常见的病原体还包括支原体、衣原体、立克次体和寄生虫等。Andersson等[27]对妇女生殖道分泌物进行了宏基因组测序分析，研究发现了沙眼衣原体的染色体和质粒，可见宏基因组测序技术在新生儿衣原体感染的临床检测中同样发挥了重要的作用。Lim等[28]对美国圣路易斯市大都会区的8名健康婴儿的粪便进行了宏基因组测序分析，研究发现比起RNA病*和DNA病*，在科的水平婴儿粪便中存在更多的是噬菌体。当然宏基因组测序技术在寄生虫临床诊断方面的应用目前还比较少，主要还是因为相较于细菌和病*感染，寄生虫病的疑难病例较少。未来潜在的研究方向还包括寄生虫基因组的特征及其对新生儿肠道微生态的影响等。
三、宏基因组测序技术应用于新生儿感染性疾病检测中存在的问题及展望
随着高通量测序技术的不断进步，宏基因组测序技术被越来越多的应用于临床感染性疾病的实验室诊断中，特别是在新生儿感染病原体的诊断方面具有重要的参考价值。在以下几种情况推荐使用宏基因组测序对新生儿感染进行诊断：（1）针对疑难重症，在先前感染原因未知和诊断复杂的情况下，利用宏基因组测序可以全面解读新生儿感染的病原体构成，分析主要病因。（2）针对多重感染和复杂感染的情况，利用宏基因组测序可以同时检测细菌、病*和真菌等多种感染病原体。（3）多次传统微生物检测分析中感染病原体筛查阴性，但又有明显感染症状的患儿，利用宏基因组测序可以克服绝大多数微生物难以培养的障碍，极大的拓宽了微生物检测的范围，同时还大大提高了实验敏感度以便能够检测到样本中丰度较低的病原体。（4）临床医生想要了解病原微生物群体的多样性、丰度、分布、功能结构和进化关系，解读病原体与环境、宿主的关系。综上，就目前临床新生儿细菌性感染疾病的实验室检测现状而言，利用测序技术检测病原体宏基因组不失为传统培养及实时荧光定量PCR病原体核酸检测外的有意义扩展实验。有助于危重疑难新生儿感染病例的快速诊断，为患者争取治疗时间，降低新生儿死亡率。尽管目前宏基因组测序技术显现出了诸多的优势，但应用于临床实际工作中仍然存在一些问题。首先，实验室检测中如何鉴别细菌定植还是感染，需要临床医生结合临床进行综合判断[12]。其次，宏基因组测序无法提供病原菌的耐药信息，需要进一步的药敏培养或者耐药基因检测进行辅助诊断。第三，面对血液、痰液、脑脊液和分泌物等多种多样的标本类型，如何建立统一规范的检测流程使得病原体的检测效能最大化困难重重。第四，样本提取的核酸中人源序列背景太高也是干扰病原体检测的一大因素。第五，在报告的解读方面，需要实验室结合样本类型、微生物特性、患者临床特征、传统病原检测结果等信息来综合判断，并把最终的结果呈现给临床医生。整个过程需要实验室检测及审核报告人员具备丰富的分子生物学知识及临床微生物感染知识。第六，生物信息数据库需要尽可能全的囊括所有病原菌，防止因基因序列未覆盖而导致的漏检。第七，检测过程中准确性和时效性都非常重要，如何权衡测序深度、交付时间以及所需经济成本等诸多因素也是实验室人员必须思考的问题。综上所述，随着高通量测序技术的发展以及检测成本的下降，宏基因组测序分析在新生儿感染性疾病诊断中的应用已经取得了良好的进展。相信未来宏基因组测序技术将会逐步解决临床新生儿感染性疾病鉴别诊断困难的问题，进一步推动临床微生物学的发展，为相关的科学研究提供新方向。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
选自中华检验医学杂志,,43(06)
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