脓*症（sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应综合征（systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS），其发病率和死亡率很高，病死率高达30%-70%，对人类健康造成巨大的威胁。近日，TimothyR.BilliarYongJiang团队为我们带来了有关脓*症的新研究成果，使用T7噬菌体展示系统筛选出SLP76作为衔接蛋白与RAGE胞质尾部相互作用，SLP76通过其不育α基序(SAM)结合RAGE介导下游信号，通过TAT细胞穿透肽将SAM结构域递送至巨噬细胞可阻断促炎性细胞因子的产生，此外，给予盲肠结扎穿孔(CLP)小鼠TAT-SAM可减轻小鼠的炎性细胞因子释放和组织损伤，并保护这些小鼠免受脓*症致死。表明SLP76在RAGE介导的促炎信号中具有重要功能，并为脓*症提供了潜在的治疗靶点。其研究结果于年1月12日，以“TargetingadaptorproteinSLP76ofRAGEasatherapeuticapproachforlethalsepsis”为题，发表在期刊《NatureCommunications》上，IF：12.。
机制图
研究背景
脓*症的模式识别受体(PRRs)包括Toll样受体(TLRs)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)等，受体对感染性病原体产生反应，导致先天免疫的压倒性激活，使促炎介质（包括细胞因子、趋化因子、生长因子和多种细胞产生的损伤相关分子模式(DAMP)分子）触发强烈的免疫应答，从而导致器官功能障碍或衰竭，甚至死亡。已有研究表明，RAGE在脓*症的病理生理过程中起重要作用，其胞内结构域是RAGE介导的细胞内信号级联激活所必需的，胞内结构域缺失的RAGE失去激活细胞的能力。T7噬菌体展示系统是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到T7噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，然后利用噬菌体特异性结合靶分子，获得识别靶分子的多肽或者蛋白的方法。CLP模型是盲肠结扎穿孔模型，利用盲肠结扎穿孔术引起组织感染、坏死，导致类似人脓*症的症状，是应用最广泛的一种脓*症模型。
研究结果
SLP76为RAGE胞内结构域的结合蛋白
用T7噬菌体展示系统鉴定与RAGE胞质尾部相互作用的蛋白，发现SLP76为RAGE胞内结构域的结合蛋白。检测SLP76与RAGE的相互作用，发现His-SLP76(带His标签的SLP76)可拉下GST-RAGE(CT)(RAGE带GST标签的细胞溶质尾)，HA标记的RAGE和Flag标记的SLP76相互作用呈剂量和时间依赖性。
RAGE和SLP76结合域的鉴定
生成了RAGE突变体，确定与SLP76相互作用的结构域，发现胞质尾结构域和DCT区域至关重要。此外，SLP76的SAM结构域缺失显著降低了SLP76和RAGE之间的相互作用，检测结合能力后发现，SLP76和RAGE之间的相互作用是由SLP76的SAM结构域和RAGE的DCT区域介导的。
AGEs对巨噬细胞中促炎信号通路的影响
用针对AGEs的特异性抗体进行了蛋白免疫印迹分析，发现RAW.7细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和IKKα/β信号通路被动态激活，然而，MAPK通路的磷酸化是选择性的，此外，随着AGEs浓度的增加，p38MAPK、ERK1/2和IKKα/β的磷酸化呈剂量依赖性。表明AGE刺激诱导的促炎信号通路（包括p38MAPK、ERK1/2和IKKα/β通路）活化是巨噬细胞中的剂量和时间依赖性过程。
SLP76在RAGE介导的信号转导不可或缺
检测SLP76在RAGE介导的细胞活化中的作用，发现单独过表达RAGE或SLP76的细胞仅表现出轻微甚至无AGE诱导的p38MAPK、ERK1/2和IKKα/β磷酸化变化，但共表达RAGE和SLP76的细胞表现出这些信号分子磷酸化显著增强。敲除RAGE和SLP76的基因表达时，p38MAPK、ERK1/2和IKKα/β的磷酸化显著降低，敲除SLP76的RAGE或SAM结构域的DCT时，AGE诱导的p38MAPK、ERK1/2和IKKα/β的磷酸化被显著抑制。结果证明SLP76对于RAGE激活介导的细胞信号是至关重要的，并且SLP76的SAM结构域和RAGE的DCT不仅是RAGE和SLP76之间的相互作用所必需的，而且是AGE/RAGE轴介导的信号转导所必需的。
SLP76在AGE诱导的细胞因子和趋化因子释放中的作用
敲除小鼠AGER或SLP76基因，分离BMDMs，发现AGER和SLP76的基因缺陷导致促炎基因（包括Tnf、Il-1b、Il6、Ccl2、Ccl3和Cxcl10）的表达水平以及相应细胞因子和趋化因子的释放显著降低。合成TAT-SAM融合肽，将SLP76的SAM结构域递送至AGE处理的RAW.7细胞中，显著抑制促炎性细胞因子和趋化因子的释放。
SLP76的SAM结构域作为脓*症的潜在治疗靶点
给CLP小鼠模型注射TAT-SAM肽，发现TAT-SAM显著改善脓*症小鼠的存活率，并以剂量依赖性方式降低脓*症小鼠的死亡率，各种促炎性细胞因子血清浓度低于对照小鼠，给予TAT-SAM肽对小鼠的肺部和肝脏组织的炎症和组织损伤具有治疗作用。
研究结论
败血症是一种与长期炎症、免疫抑制和器官损伤相关的危及生命的疾病。使用抗生素控制感染进展是脓*症和脓*性休克的主要治疗策略，但其治疗效果并不令人满意。在本研究中，使用T7噬菌体展示系统，将衔接蛋白SLP76鉴定为RAGE胞质尾部的结合蛋白。鉴定与RAGE结合的SLP76的特异性结构域，发现SAM结构域对于SLP76与RAGE胞质尾部的相互作用和AGE诱导的信号转导不可或缺。给CLP小鼠模型注射TAT-SAM肽，发现其抑制细胞因子释放，降低血液中HMGB1(RAGE的体内配体)的浓度，组织损伤显著减少，小鼠生存期延长。因此，RAGE与其配体的相互作用将SLP76招募到胞质尾部RAGE，导致下游信号通路快速激活，从而启动促炎介质（包括TNF、IL-6、CXCL10、HMGB1等）的基因转录，上调的HMGB1与RAGE结合，触发并放大炎症反应，通过这种正反馈机制，产生大量促炎因子，引起持续的炎症反应和重度组织损伤，最终导致小鼠多器官衰竭和死亡。
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脓*症动物模型
脓*症是非冠状动脉重症监护病房(ICU)死亡的主要原因，其特征是危及生命的感染伴器官功能障碍，其发病率和死亡率很高。脓*症动物模型是研究脓*症发病机制、治疗策略以及临床治疗方法的重要媒介，根据脓*症的发病因素、病理生理学变化以及临床特征，脓*症动物模型需具备以下特点：
①有脓*症典型的高排低阻血流动力学和高代谢状态；
②伴发多个器官功能障碍；
③有较高的自然死亡率，死亡率达50%-70%；
④出现器官功能障碍及死亡距模型制备应有一定的时间间距，一般6-12h后发生器官功能障碍或死亡。
展示
采用盲肠结扎穿孔法(cecalligationandpuncture，CLP)，通过破坏肠道屏障，引起肠内菌丛持续性弥漫释放，模拟临床阑尾炎或憩室炎穿孔导致腹膜感染而引起脓*症。
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